CONTRÔLE QUALITÉ NGS

Abstract

Le contrôle qualité NGS ne se limite pas à l’évaluation des scores de séquençage ou de la profondeur de couverture. Il concerne l’ensemble du processus analytique, depuis la réception de l’échantillon jusqu’à la restitution du résultat. Il inclut la qualité du matériel biologique, la préparation des librairies, les performances du run, la validation du pipeline bioinformatique, la détection des contaminations, l’identitovigilance et la traçabilité.

Cette page présente les principaux niveaux de contrôle nécessaires à la fiabilité d’une analyse NGS. Elle décrit les critères applicables aux échantillons et aux librairies, les métriques utilisées pendant le séquençage, les contrôles bioinformatiques effectués sur les fichiers FASTQ, l’alignement et la détection des variants, ainsi que les exigences normatives relatives à la qualité et à la compétence des laboratoires.

Elle examine également les limites des dispositifs conventionnels, notamment lorsque les identifiants restent associés à un tube, une plaque ou un enregistrement informatique. Dans ce contexte, l’utilisation de séquences d’ADN synthétique peut apporter un niveau de contrôle complémentaire.

L’approche développée par GENARO repose sur l’association d’une étiquette d’ADN synthétique, ARIADNA, à l’échantillon biologique. Encodée et décodée par l’algorithme NATAN, cette étiquette peut transporter un identifiant unique ou des métadonnées utiles à la traçabilité, à l’identitovigilance et à la détection de contaminations croisées.

Sommaire

1. Qu’est-ce que le contrôle qualité NGS ?
2. Contrôle qualité de l’échantillon biologique
3. Contrôle qualité des librairies NGS
4. Contrôle qualité du run de séquençage
5. Contrôle qualité bioinformatique des données NGS
   • Contrôle des fichiers FASTQ
   • Contrôle après alignement
   • Contrôle de la détection des variants
6. Identitovigilance et traçabilité des échantillons NGS
7. Détection des contaminations en NGS
8. Contrôle qualité et assurance qualité NGS
9. Les limites des contrôles qualité NGS conventionnels
10. L’approche de contrôle qualité NGS développée par GENARO
11. Validation d’un contrôle synthétique dans un workflow NGS
12. FAQ sur le contrôle qualité NGS
13. Le contrôle qualité NGS doit couvrir l’ensemble du processus
14. Références

 

 

Le contrôle qualité NGS désigne l’ensemble des vérifications réalisées avant, pendant et après un séquençage à haut débit. Il concerne le matériel biologique, la préparation des librairies, le fonctionnement du séquenceur, les traitements bioinformatiques, l’interprétation des résultats, l’identitovigilance et la traçabilité des échantillons.

Cette définition est plus large que l’usage courant du terme « QC NGS », souvent limité aux scores de qualité, au nombre de reads ou à la profondeur de couverture. Ces indicateurs sont nécessaires, mais ils ne suffisent pas à valider une analyse. Un run peut présenter de bonnes performances alors qu’un échantillon a été dégradé, contaminé, interverti ou associé à un identifiant incorrect.

Le contrôle qualité doit donc porter sur l’ensemble du processus, depuis la réception du prélèvement jusqu’à la restitution du résultat.

 

Qu’est-ce que le contrôle qualité NGS ?

 

Le NGS, ou Next-Generation Sequencing, permet de séquencer simultanément un grand nombre de fragments d’ADN ou d’ARN. Selon l’application, il peut être utilisé pour analyser un panel de gènes, un exome, un génome complet, un transcriptome ou un microbiome.

Le processus comprend plusieurs opérations successives : identification de l’échantillon, extraction, quantification, préparation de la librairie, indexation, pooling, séquençage, démultiplexage, alignement, détection des variants, annotation et interprétation.

Le guide SH GTA 16 du Cofrac consacré au séquençage à haut débit décrit cette chaîne et intègre l’analyse bioinformatique dans le processus analytique. Il distingue les phases pré-analytiques, analytiques et post-analytiques, depuis l’échantillon biologique jusqu’au compte rendu.

Chaque étape peut introduire une erreur ou un biais. Les contrôles doivent donc être définis en fonction de la méthode et de son usage prévu. Il n’existe pas de seuil universel applicable à toutes les analyses NGS. Un panel d’oncologie destiné à détecter des variants à faible fréquence n’a pas les mêmes exigences qu’un séquençage constitutionnel, une analyse RNA-seq ou une étude métagénomique.

Les critères d’acceptation sont établis lors de la validation ou de la vérification de la méthode, puis suivis en routine. Les recommandations conjointes de l’Association for Molecular Pathology et du College of American Pathologists demandent notamment de documenter les performances pour chaque type de variant recherché, les matériaux de référence utilisés, la profondeur minimale et la limite de détection.

Un dispositif complet couvre cinq niveaux :

1. la conformité et la qualité de l’échantillon biologique ;
2. la qualité de l’extraction et de la librairie ;
3. la performance du run de séquençage ;
4. la qualité des données et du pipeline bioinformatique ;
5. l’identité, la traçabilité et l’absence de contamination significative.

 

Contrôle qualité de l’échantillon biologique

 

Le laboratoire doit vérifier que l’échantillon reçu est conforme à la demande et compatible avec la méthode. Les critères d’acceptation varient selon la matrice : sang total, plasma, tissu frais, tissu fixé et inclus en paraffine, salive, cellules, écouvillon, ADN ou ARN extrait.

Le contrôle porte d’abord sur l’identification, le contenant, le volume, les conditions de transport, le délai avant traitement et la conservation. Une température inadaptée ou un délai excessif peut dégrader les acides nucléiques avant leur analyse.

Après extraction, la quantité, la pureté et l’intégrité de l’ADN ou de l’ARN doivent être évaluées. La concentration peut être mesurée par spectrophotométrie, fluorimétrie, PCR quantitative ou PCR digitale. Ces méthodes ne fournissent pas la même information.

La spectrophotométrie mesure l’absorbance globale de l’échantillon et peut être influencée par la présence de protéines, de solvants ou d’autres contaminants. La fluorimétrie utilise des réactifs plus spécifiques des acides nucléiques. Les méthodes fondées sur la PCR renseignent davantage sur la fraction de molécules effectivement amplifiables.

La concentration ne suffit pas à qualifier un échantillon. Une quantité importante d’ADN peut être fortement fragmentée ou chimiquement altérée. L’intégrité doit être examinée en fonction de l’application, notamment par électrophorèse, analyse microfluidique ou amplification de fragments de tailles différentes.

Pour l’ARN, des indicateurs tels que le RIN, ou RNA Integrity Number, peuvent être utilisés. Ils ne constituent toutefois pas un critère universel. Leur interprétation dépend du type de prélèvement, de la méthode d’extraction et de l’analyse prévue.

Les seuils ne sont pas transposables d’une méthode à l’autre. Un ADN fragmenté provenant d’un tissu fixé au formol et inclus en paraffine peut convenir à un panel à amplicons courts et être inadapté à une autre technique. La procédure doit préciser les conditions d’acceptation, de rejet ou d’analyse sous réserve.

 

Contrôle qualité des librairies NGS

 

La préparation de librairie transforme les acides nucléiques en molécules compatibles avec la plateforme de séquençage. Selon le protocole, elle peut comprendre une fragmentation, une réparation des extrémités, une ligation d’adaptateurs, une amplification, une capture de cibles et l’ajout d’index.

Le contrôle qualité des librairies NGS évalue principalement leur concentration, leur distribution de taille, leur pureté et leur complexité.

Une librairie sous-concentrée peut produire un rendement insuffisant. Une quantification imprécise peut déséquilibrer un pool multiplexé : certains échantillons reçoivent alors un nombre de reads inférieur à celui prévu, tandis que d’autres sont surreprésentés.

Les dimères d’adaptateurs peuvent occuper une partie de la capacité de séquençage sans générer d’information biologique utile. Une amplification excessive peut augmenter le taux de duplicats et réduire la diversité moléculaire réellement disponible pour l’analyse.

La concentration molaire tient compte de la concentration massique et de la taille moyenne des fragments. Selon le protocole, elle peut être estimée par fluorimétrie, PCR quantitative ou PCR digitale. L’analyse de la distribution de taille est généralement réalisée par électrophorèse capillaire ou microfluidique.

Les critères d’acceptation doivent être adaptés à chaque préparation. Une librairie d’amplicons ciblés, une librairie d’exome, une librairie WGS sans PCR et une librairie RNA-seq ne présentent ni les mêmes profils ni les mêmes sources de biais.

Les index servent à attribuer les reads aux différentes librairies après un run multiplexé. Les UMI, ou identifiants moléculaires uniques, permettent de distinguer certaines molécules initiales et peuvent améliorer la correction des erreurs ou l’évaluation des duplicats.

Index et UMI ont une fonction analytique précise. Ils ne garantissent cependant pas l’identité de l’échantillon avant leur introduction pendant la préparation de librairie.

 

Contrôle qualité du run de séquençage

 

Le contrôle du run vérifie le fonctionnement de l’instrument, la qualité des réactifs, le chargement de la librairie et la production des données brutes. Les métriques disponibles varient selon les plateformes et les technologies de séquençage.

Les indicateurs courants comprennent :

• le nombre total de reads ;
• le rendement global ;
• la proportion de reads passant les filtres ;
• la répartition des index ;
• la densité de clusters pour certaines plateformes ;
• le taux d’erreur estimé ;
• la proportion de bases atteignant un score de qualité donné ;
• les performances des contrôles internes.

Le score Phred exprime une probabilité estimée d’erreur de base calling, c’est-à-dire une erreur dans l’identification d’une base. Un score Q30 correspond à une probabilité d’erreur théorique de 1 sur 1 000 pour la base concernée. La note technique d’Illumina consacrée aux scores de qualité décrit cette relation entre le score Q et la probabilité d’erreur.

Le pourcentage de bases Q30 est utile pour suivre les performances du séquençage, mais il ne valide pas le run à lui seul. Il ne renseigne pas directement sur l’identité des échantillons, l’uniformité de couverture, la complexité des librairies ou la sensibilité réelle de la méthode.

Une valeur moyenne satisfaisante peut également masquer une baisse de qualité localisée sur une lecture, une partie des cycles ou une zone de la surface de séquençage.

Les résultats doivent être comparés aux spécifications de la plateforme, aux performances établies pendant la validation et à l’historique du laboratoire. Le suivi longitudinal des métriques permet de détecter une dérive progressive, même lorsque chaque run reste formellement à l’intérieur des limites d’acceptation.

 

Contrôle qualité bioinformatique des données NGS

 

Le contrôle qualité bioinformatique commence avec les données brutes et se poursuit jusqu’au résultat interprétable. Il ne doit pas être considéré comme une opération indépendante du reste de la méthode.

Le Cofrac précise que les outils, les paramètres, les versions logicielles, les bases de données et les références génomiques doivent être documentés et intégrés au système de management de la qualité. Il demande également la traçabilité des fichiers intermédiaires, des seuils et des modifications apportées au pipeline.

 

Contrôle des fichiers FASTQ

Pour les fichiers FASTQ, les contrôles portent notamment sur :

• la qualité des bases selon leur position dans les reads ;
• la teneur en GC ;
• la longueur des reads ;
• les séquences surreprésentées ;
• la présence d’adaptateurs ;
• les bases indéterminées ;
• le taux de duplication ;
• les biais de composition.

FastQC fournit une première analyse modulaire de ces paramètres. Son rapport signale les profils susceptibles de révéler un problème, mais il ne décide pas de la conformité d’un échantillon ou d’un run. Certaines alertes sont attendues pour des librairies ciblées, de petits ARN ou des données présentant volontairement une faible diversité.

Un rapport FastQC ne doit donc pas être interprété comme une succession automatique de validations ou de rejets. Les résultats doivent être confrontés au type de librairie et à la finalité de l’analyse.

 

Contrôle après alignement

Après alignement, le contrôle porte notamment sur :

• le taux de mapping ;
• la qualité d’alignement ;
• la profondeur de séquençage ;
• l’uniformité de couverture ;
• la distribution des tailles d’insert ;
• le taux de duplication ;
• la couverture des régions d’intérêt ;
• les biais de brin ou de position.

La profondeur moyenne est un indicateur incomplet. Une moyenne élevée peut masquer des exons, des amplicons ou des régions insuffisamment couverts. Pour une analyse ciblée, il est souvent plus pertinent de suivre la proportion de bases ou de régions dépassant un seuil minimal défini lors de la validation.

 

Contrôle de la détection des variants

La détection des variants doit être évaluée pour chaque catégorie revendiquée :

• substitutions nucléotidiques ;
• insertions et délétions ;
• variations du nombre de copies ;
• réarrangements structuraux ;
• variants à faible fréquence allélique.

Une méthode performante pour la détection des SNV n’est pas automatiquement performante pour les CNV, les indels complexes ou les variants structuraux. Chaque classe de variants possède ses propres difficultés analytiques et ses propres limites.

Le pipeline bioinformatique doit faire l’objet d’une validation spécifique. Les recommandations AMP–CAP relatives à la validation des pipelines bioinformatiques NGS couvrent leur conception, leur développement, leur mise en production et leur maintien. Elles insistent sur l’utilisation de jeux de données de référence, la connaissance des limites, la traçabilité des versions et le contrôle des modifications.

Une mise à jour d’un logiciel, d’un algorithme, d’une base d’annotation, du génome de référence ou d’un paramètre peut modifier les résultats. Elle doit être évaluée avant mise en production, avec des tests de non-régression lorsque la détection, le filtrage ou l’interprétation peuvent être affectés.

 

Identitovigilance et traçabilité des échantillons NGS

 

L’identitovigilance consiste à vérifier que le résultat est attribué au bon patient, au bon donneur, au bon organisme ou au bon lot biologique.

Le risque sur l’identitovigilance existe à chaque changement de contenant, de plaque, d’opérateur, d’équipement ou de système informatique. Les points critiques comprennent la réception, l’aliquotage, l’extraction, les transferts de plaque, la préparation de librairie, l’indexation, le pooling, le démultiplexage et l’association entre les fichiers et le dossier.

Une inversion survenue avant l’ajout des index peut produire des données techniquement correctes, mais attribuées au mauvais échantillon.

La fiche SH INF 37 du Cofrac sur les risques liés au NGS cite explicitement les erreurs d’identitovigilance. Elle recommande des procédures d’identification strictes, une double vérification à la réception, des contrôles d’identitovigilance et une stratégie permettant de vérifier la traçabilité des échantillons. Ces dispositions sont particulièrement importantes lorsque plusieurs laboratoires, services support ou fournisseurs interviennent dans le processus.

Les moyens conventionnels comprennent :

• les codes-barres ;
• les systèmes LIMS ;
• les feuilles de travail ;
• les doubles vérifications ;
• les tables de correspondance entre échantillons et index ;
• les contrôles de concordance génétique.

Des SNP, des STR, le sexe génétique attendu ou des profils génotypiques peuvent être utilisés pour vérifier une concordance. Ces contrôles nécessitent toutefois un profil de référence ou des données comparables et ne sont pas adaptés de la même manière à toutes les matrices.

La traçabilité ne concerne pas seulement l’identité de l’échantillon. Elle doit relier le résultat aux lots de réactifs, aux opérateurs, aux instruments, aux paramètres du pipeline, aux versions logicielles, aux témoins et aux non-conformités enregistrées.

 

Détection des contaminations en NGS

 

Une contamination peut provenir de l’environnement, des réactifs, d’un opérateur, d’un autre échantillon ou d’un événement survenu pendant la préparation de librairie et le séquençage.

Son impact dépend de la matrice, de la concentration initiale, de la profondeur et de la limite de détection recherchée. Une contamination faible peut être critique pour l’analyse de variants à faible fréquence, de l’ADN tumoral circulant, des échantillons à faible biomasse, de la métagénomique ou du séquençage de cellules uniques.

La prévention repose sur la séparation des zones, l’organisation des flux, les procédures de nettoyage, les témoins négatifs et les contrôles de processus.

Le contrôle bioinformatique peut rechercher des séquences exogènes, des mélanges de génotypes, des proportions alléliques anormales ou des similarités inattendues entre plusieurs échantillons du même run.

Des contrôles synthétiques ajoutés au début du processus peuvent compléter ces mesures. Une étude publiée dans Scientific Reports a utilisé des séquences synthétiques 16S pour suivre des échantillons et détecter des échanges ou des contaminations croisées dans un workflow de séquençage d’amplicons. Les contrôles étaient ajoutés au début du processus, puis recherchés dans les données finales.

Une étude publiée dans Nature Microbiology a ensuite décrit 96 séquences d’ADN synthétique utilisées pour le suivi d’échantillons et la détection de contaminations inter-échantillons dans des workflows de séquençage du SARS-CoV-2.

Ces travaux établissent la faisabilité scientifique du principe. Les performances obtenues dans ces études ne peuvent cependant pas être transposées sans validation à une autre matrice, à un autre protocole ou à une autre technologie.

 

Contrôle qualité et assurance qualité NGS

 

Le contrôle qualité correspond aux mesures appliquées aux échantillons, aux librairies, aux runs et aux données.

L’assurance qualité couvre l’organisation qui garantit la maîtrise durable de ces opérations : validation des méthodes, qualification des équipements, habilitation du personnel, gestion documentaire, gestion des risques, audits, contrôles internes, évaluations externes et traitement des non-conformités.

Dans les laboratoires de biologie médicale, la norme internationale ISO 15189:2022 définit les exigences relatives à la qualité et à la compétence. Elle s’applique au système de management et à l’évaluation de la compétence du laboratoire.

Pour le NGS, les documents SH GTA 16 et SH INF 37 du Cofrac précisent l’application de ces principes aux différentes phases de l’analyse.

Le SH INF 37, applicable depuis le 1er mai 2026, demande notamment de définir des métriques qualité, de suivre les performances analytiques et de maîtriser les risques liés à l’identitovigilance, aux données, aux méthodes et aux collaborations externes.

La conformité ne peut donc pas être réduite à une liste de métriques instrumentales. Elle suppose de démontrer que le processus complet produit un résultat valide et traçable.

 

Les limites des contrôles qualité NGS conventionnels

 

Les contrôles conventionnels évaluent la qualité des acides nucléiques, la préparation de librairie, le séquenceur, la couverture et le pipeline. Ils sont indispensables.

Leur limite tient au fait que la plupart des identifiants restent associés à un tube, une plaque, une position ou un enregistrement informatique. Une erreur de transfert peut maintenir une chaîne documentaire cohérente autour d’un échantillon mal attribué.

Les index sont ajoutés pendant la préparation de librairie. Ils permettent le démultiplexage, mais ne renseignent pas sur les opérations antérieures à leur introduction.

Les contrôles de concordance génétique reposent sur le profil génétique et nécessitent une référence ou un échantillon de comparaison. Ils ne sont pas applicables de manière identique à tous les échantillons et à toutes les applications.

Un contrôle automatisé et pro-actif introduit plus tôt dans le processus et physiquement associé à l’échantillon peut donc optimiser significativement tout les dispositifs de contrôle existants.

 

L’approche de contrôle qualité NGS développée par GENARO

 

GENARO développe une méthode d’association de métadonnées à un échantillon biologique, au plus près du prélèvement, sous la forme d’une séquence d’ADN synthétique transportant de l’information utile (métadonnées) encodée selon les besoins.

Le procédé repose sur deux éléments principaux :

• NATAN, un algorithme d’encodage et de décodage spécifiquement développé par GENARO ;
• ARIADNA, une étiquette d’ADN synthétique porteuse des informations encodées.

Selon la présentation du procédé GENARO, NATAN convertit des caractères alphanumériques en séquences nucléotidiques. Celles-ci sont ensuite synthétisées et peuvent être ajoutées au processus au plus tôt pendant la phase pré-analytique. Après le séquençage, l’étiquette est recherchée dans les données et son contenu est décodé.

L’étiquette ARIADNA est destinée à porter un identifiant unique indépendant du profil génétique et, selon le cas d’usage, des métadonnées ou des instructions informatiques. L’objectif est de maintenir une association entre le matériel biologique et l’information nécessaire à son identification ou à son traitement.

Dans un dispositif de contrôle qualité NGS, cette approche peut être étudiée pour :

• vérifier la présence de l’identifiant attendu dans les données ;
• signaler la présence d’un identifiant non attendu ;
• renforcer la traçabilité entre l’échantillon, la librairie et les fichiers ;
• transporter des métadonnées définies pour le processus ;
• contribuer à la détection ou à la quantification de contaminations croisées.

Ces fonctions doivent être validées pour le protocole concerné. Une séquence synthétique ne remplace pas la quantification des acides nucléiques, le contrôle des librairies, les métriques du run, les témoins analytiques ou la validation du pipeline.

Elle porpose un contrôle pro-actif et automatisé centré sur l’identité de l’échantillon, sa traçabilité et la provenance des données.

 

Validation d’un contrôle synthétique dans un workflow NGS

 

L’intégration d’un contrôle synthétique doit être évaluée dans son contexte d’utilisation. La validation commence par une cartographie du workflow et par l’identification des points où une inversion, une contamination ou une rupture de traçabilité peut se produire.

Le protocole doit définir :

• le moment d’introduction du contrôle ;
• sa concentration ;
• sa stabilité ;
• son rendement pendant l’extraction ;
• son comportement pendant la préparation de librairie ;
• sa détectabilité dans les données ;
• son éventuel impact sur l’analyse principale.

Les performances à documenter comprennent la spécificité, la sensibilité de détection, la répétabilité, la reproductibilité, la robustesse et l’absence d’interférence.

Si le contrôle est utilisé pour estimer une contamination, la relation entre le signal mesuré et la proportion de contamination doit être établie expérimentalement. Une proportion de reads provenant du contrôle ne peut pas être assimilée automatiquement à une proportion de matériel biologique contaminant sans modèle et sans validation.

La validation informatique doit couvrir la détection de la séquence, le décodage, les seuils de décision, la traçabilité des versions et le traitement des résultats inattendus. Les principes décrits par l’AMP, le CAP et le Cofrac restent applicables à cette couche supplémentaire du processus.

 

 

FAQ

Quels sont les principaux critères de qualité en NGS ?

Ils comprennent la quantité, la pureté et l’intégrité des acides nucléiques, la concentration et la taille des librairies, le rendement du run, les scores de qualité, le taux d’alignement, la profondeur, l’uniformité de couverture, le taux de duplication, les performances des témoins et la traçabilité de l’échantillon.

Un score Q30 élevé garantit-il la qualité d’une analyse NGS ?

Non. Le Q30 estime la probabilité d’erreur de base calling. Il ne renseigne pas directement sur l’identité de l’échantillon, la couverture des régions d’intérêt, la contamination, la complexité de la librairie ou les performances du pipeline.

Quelle est la différence entre contrôle qualité et assurance qualité NGS ?

Le contrôle qualité regroupe les mesures réalisées sur les échantillons, les librairies, les runs et les données. L’assurance qualité comprend l’organisation, les procédures, les compétences, les validations et les évaluations qui permettent de maintenir ces performances dans le temps.

Comment contrôler l’identité d’un échantillon NGS ?

Le laboratoire peut utiliser des codes-barres, un LIMS, des doubles vérifications, des contrôles de concordance génétique, des marqueurs internes ou une combinaison de ces moyens. Le choix dépend de la matrice, du niveau de risque et de l’usage prévu.

Quelle est la différence entre un index NGS et une étiquette synthétique ?

Un index est ajouté pendant la préparation de librairie afin d’attribuer les reads aux différents échantillons après un run multiplexé. Une étiquette synthétique peut être associée plus tôt au matériel biologique et porter un identifiant indépendant du profil génétique.

Comment détecter une contamination croisée en NGS ?

La détection peut reposer sur des témoins négatifs, l’analyse de séquences exogènes, les fréquences alléliques, la concordance génotypique ou des contrôles synthétiques. Aucun indicateur unique ne convient à toutes les applications.

 

Le contrôle qualité NGS doit couvrir l’ensemble du processus

Un contrôle qualité NGS fiable ne se limite pas à la qualité des reads. Il doit vérifier la conformité de l’échantillon, la préparation de la librairie, le fonctionnement du run, les performances du pipeline bioinformatique et la traçabilité du résultat.

L’approche développée par GENARO consiste à optimiser ces contrôles de manière automatisée et pro-active. L’information utile – ex : référence unique – est transportée par une séquence d’ADN synthétique (ARIADNA) associée à l’échantillon dès l’entrée au laboratoire, voire dès le prélèvement.

 

Références

International Organization for Standardization. ISO 15189:2022 — Medical laboratories: Requirements for quality and competence. ISO, quatrième édition, 2022.

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