Les contaminations NGS représentent un risque majeur pour la fiabilité des analyses génomiques. Les principaux risques concernent les contaminations croisées entre échantillons, les contaminations liées aux réactifs, les contaminations de laboratoire, les transferts entre puits, les erreurs de manipulation et les phénomènes d’index hopping.
Cette page explique leurs causes, leurs impacts et les solutions qui renforcent la traçabilité des échantillons.
Elle présente également l’approche développée par GENARO qui consiste à attribuer à chaque échantillon une identité moléculaire unique indépendante de son profil génétique. Cette méthode automatise et optimise l’identitovigilance et la traçabilité des échantillons tout au long du parcours NGS. Elle permet la détection et la quantification automatique des contaminations sur l’ensemble des phases pré-analytiques, analytiques et post-analytiques.
Pourquoi les contaminations NGS sont un enjeu majeur
Un run peut sembler parfait et pourtant cacher un mélange entre échantillons. Les scores restent bons. Les reads sont nombreux. Cependant, le résultat peut contenir un signal qui vient d’ailleurs.
Les contaminations NGS touchent directement la confiance dans les données. Elles concernent aussi l’identité de chaque échantillon. Le risque existe pendant plusieurs étapes du parcours NGS.
Le contrôle qualité doit couvrir ce parcours complet. Il ne suffit pas d’examiner les performances du séquenceur.
Ce sujet prolonge le guide GENARO consacré au contrôle qualité NGS. [7]
D’où viennent les contaminations NGS ?
Le problème n’a pas une seule origine. Un ADN étranger peut venir de l’environnement. Les réactifs peuvent contenir des traces d’ADN.
Un opérateur humain ou robotique peut aussi déplacer du matériel entre deux échantillons. De même, un transfert entre puits peut provoquer une contamination croisée, un mélange ou une inversion d’échantillons. Les étapes de librairie ajoutent encore d’autres points de risque.
Enfin, certains événements surviennent pendant le séquençage. Les contaminations NGS doivent donc être étudiées sur toute la chaîne. [1][2]
Le risque commence avant le séquençage
La phase pré-analytique mérite une attention particulière. Elle regroupe l’ensemble des actions réalisées depuis le prélèvement biologique du patient jusqu’à la mise en route du séquençage qui débute par la préparation de librairie. Elle inclut notament la préparation des acides nucléiques à l’entrée dans le laboratoire.
Un échantillon biologique ou l’un des ses dérivés nucléique change parfois de tube, de plaque ou de poste. Chaque transfert ouvre un nouveau point de vigilance. Une erreur précoce peut suivre l’échantillon jusqu’au résultat et compromettre son interprétation.
Les organismes d’accréditation, tels que le Cofrac, recommandent des mesures pour prévenir les contaminations. Le Cofrac préconise en particulier le contrôle de l’environnement du laboratoire et des zones de travail.[1]
Index hopping : un risque propre au multiplexage
Les index ajoutés lors de la préparation de librairie permettent d’identifier et de démultiplexer les librairies après un run multiplexé. L’index hopping peut entraîner l’attribution de reads à une mauvaise librairie.
Ce phénomène ne correspond pas à un mélange physique des échantillons. Pourtant, il peut imiter une contamination dans les données. Illumina décrit ce risque comme une mauvaise attribution de librairie. [3]
Le retrait des adaptateurs libres réduit aussi le risque. Les doubles index uniques limitent son impact sur l’analyse. [3]
Pourquoi certaines analyses sont plus sensibles
Toutes les analyses ne réagissent pas de la même façon. En effet, l’impact dépend d’abord du type d’échantillon.
La quantité d’ADN initiale compte également. Dans les échantillons à faible biomasse, l’ADN contaminant peut représenter une part importante du signal détecté. Ces échantillons nécessitent donc une vigilance renforcée. [2]
La profondeur de lecture modifie également l’impact observé. Plus la limite de détection visée est basse, plus un faible niveau de contamination peut devenir critique, notamment pour la détection de variants rares.
Le risque augmente également dans les applications nécessitant une forte sensibilité, comme l’analyse de l’ADN tumoral circulant, le séquençage unicellulaire ou certaines analyses métagénomiques. Dans ces contextes, des contaminations même faibles peuvent compromettre la validité du résultat.
Comment détecter les contaminations NGS ?
Aucun indicateur unique ne couvre tous les cas. Les laboratoires doivent donc combiner plusieurs contrôles.
Les témoins négatifs à chaque étape de réaction révèlent certaines sources d’ADN extérieures (réactifs, eau, air ambiant,…). Ensuite, l’analyse des données peut repérer des séquences non attendues. Elle peut aussi montrer des mélanges de profils génétiques.
Des proportions alléliques anormales peuvent donner une autre alerte. Par ailleurs, des ressemblances inattendues entre échantillons méritent une enquête [4]. Un résultats rare qui est obtenu un peu trop souvent.
Les contaminations NGS demandent donc une lecture croisée de plusieurs signaux. Ainsi, le contexte de l’analyse est essentiel, par exemple au regard de l’interprétation du résultat dans son environnement clinique.
Les limites des contrôles classiques
Les contrôles actuels restent indispensables. Cependant, chacun répond à une question précise.
Un témoin négatif peut montrer une pollution du processus. En revanche, il n’identifie pas toujours l’échantillon qui l’a causée.
Les index permettent d’attribuer les reads après multiplexage. Pourtant, ils arrivent pendant la préparation de librairie. Ils ne suivent donc pas les étapes réalisées avant leur ajout.
Les contrôles génétiques peuvent vérifier une concordance. Toutefois, ils dépendent du profil génétique disponible. Ils ne conviennent donc pas à tous les cas.
Lorsqu’une anomalie apparaît, son origine reste parfois difficile à retrouver. Les contaminations NGS peuvent alors imposer des vérifications longues.
Dans certains cas, le laboratoire peut rejeter le run. Un nouveau prélèvement peut parfois devenir nécessaire. [7]
Dans les fait, les résultats sont retardés et les coûts augmentent tout autant. Les résultats ne sont pas contributifs et la nécessité de re-dosage devient obligatoire sans avoir clairement identifié les causes et les étapes de contamination. Ceci prorvoquant des investigations poussées pouvant aller jusqu’à l’arrêt total de l’activité.
Contaminations NGS : ce que montrent les contrôles synthétiques
Des équipes ont testé une autre approche. Elles ajoutent une séquence synthétique connue à chaque échantillon.
En 2018, une étude a suivi des échantillons de microbiome ainsi marqués. Les chercheurs ont détecté des échanges entre échantillons. [5]
Une étude de 2022 a testé un principe proche . Les chercheurs ont attribué une identité unique à des séquences synthétiques par des méthodes de génie génétique de laboratoire de recherche non industrialisables, avec un nombre maximal de séquence unique limité. Cette fois, les chercheurs ont suivi 6 676 échantillons SARS-CoV-2. Ils ont repéré des échanges et des inversions d’échantillons. [6]
Ces travaux montrent la faisabilité du principe. Cependant, leurs performances ne peuvent pas être extrapolées à tous les protocoles. Chaque usage exige donc sa propre validation.
La détection des contaminations NGS peut ainsi bénéficier d’un contrôle interne supplémentaire, sous la forme d’un contrôle d’ADN exogène.
L’approche GENARO pour renforcer la traçabilité
GENARO développe une méthode qui associe à chaque échantillon biologique, dès l’entrée au laboratoire, voire dès le prélèvement, une séquence d’ADN synthétique transportant des métadonnées encodées selon les besoins. La première application concrète de cette innovation est l’automatisation et l’optimisation de la détection et de la quantification des contaminations NGS.
Le procédé consiste à attribuer à chaque échantillon biologique une identité moléculaire unique indépendante de son profil génétique. Il repose sur deux éléments principaux :
- NATAN, un algorithme d’encodage et de décodage spécifiquement développé par GENARO ;
- ARIADNA, une étiquette d’ADN synthétique porteuse des informations encodées.
Selon la présentation du procédé GENARO, NATAN convertit des caractères alphanumériques en séquences nucléotidiques. Celles-ci sont ensuite synthétisées et peuvent être ajoutées à différentes étapes du processus selon les besoins, mais au plus tôt pendant la phase pré-analytique, et même lors du prélèvement biologique. Après le séquençage, l’étiquette est recherchée en priorité dans les données. Chaque ARIADNA est discriminée et authentifiée. Les données transportées peuvent alors être décodées.
Chaque étiquette ARIADNA porte donc un identifiant unique indépendant du profil génétique de l’échantillon auquel elle a été ajoutée. Selon le cas d’usage, ARIADNA peut aussi transporter des métadonnées et/ou des instructions informatiques. L’objectif est de maintenir une association entre le matériel biologique et l’information nécessaire à son identification, à son traitement et automatiser les analyses par lecture d’une partie du code contenu dans ARIADNA.
Dans un dispositif de détection des contaminations ngs, cette approche permet :
- vérifier la présence de l’identifiant attendu dans les données pour chacun des échantillons ;
- signaler la présence d’un identifiant non attendu ;
- renforcer la traçabilité entre l’échantillon, la librairie et les fichiers ;
- transporter des métadonnées définies pour le processus ;
- contribuer à la détection ou à la quantification de contaminations croisées.
- valider ou invalider les résultats pour chaque échantillon d’un run dans lequel aurait été identifiée une source de contamination.
Ces fonctions doivent être validées pour le protocole concerné. Une séquence synthétique ne remplace pas la quantification des acides nucléiques, le contrôle des librairies, les métriques du run, les témoins analytiques ou la validation du pipeline.
La méthode permet ainsi un contrôle proactif et automatisé centré sur l’identité de l’échantillon, sa traçabilité et la provenance des données. [7]
Contaminations NGS et contrôle qualité : une approche complémentaire
GENARO ne remplace pas les contrôles existants. Au contraire, la méthode ajoute une couche liée à l’identité.
Les équipes doivent toujours contrôler les échantillons et les librairies. Elles doivent aussi suivre les métriques du run. Enfin, le pipeline informatique doit rester validé.
Une ARIADNA apporte une information indépendante du profil génétique. Associée à l’échantillon, elle lui confère une identité moléculaire unique. De plus, son introduction précoce élargit la partie du parcours suivie.
La mesure d’un mélange demande toutefois une validation expérimentale. Ainsi, chaque protocole doit définir ses seuils et ses performances.
Cette prudence évite une promesse excessive. Les contaminations NGS restent un risque à gérer par plusieurs moyens.
Questions fréquentes sur les contaminations NGS
Qu’est-ce qu’une contamination croisée en NGS ?
Une contamination croisée mélange du matériel issu de deux échantillons. Elle peut survenir pendant plusieurs étapes. Par conséquent, sa détection demande souvent plusieurs contrôles.
L’index hopping est-il une contamination ?
Pas au sens d’un mélange physique. Cependant, il attribue certaines lectures au mauvais index. Il peut donc créer un signal trompeur dans les données.
Comment limiter les risques au laboratoire ?
D’abord, les équipes séparent les zones de travail. Elles organisent les flux et nettoient les postes, robotisent les transferts de tube à tube. Ensuite, les témoins négatifs surveillent certaines sources de pollution.
La traçabilité complète ces mesures. Par ailleurs, des contrôles internes peuvent révéler des échanges entre échantillons.
Sources
[1] Cofrac. SH INF 37 — Évaluation des risques liés à la réalisation d’examens de séquençage du génome par séquençage haut débit. Révision 00, applicable depuis le 1er mai 2026.
Consulter le document Cofrac
[2] Salter SJ et al. Reagent and laboratory contamination can critically impact sequence-based microbiome analyses. BMC Biology. 2014;12:87. DOI : 10.1186/s12915-014-0087-z.
Consulter l’article scientifique
[3] Illumina. Index Hopping — Minimize index hopping in multiplexed runs. Documentation technique sur les causes et la réduction des erreurs d’attribution.
Consulter la documentation Illumina
[4] Jun G et al. Detecting and estimating contamination of human DNA samples in sequencing and array-based genotype data. American Journal of Human Genetics. 2012;91:839–848. DOI : 10.1016/j.ajhg.2012.09.004.
Consulter l’article sur PubMed
[5] Tourlousse DM, Ohashi A, Sekiguchi Y. Sample tracking in microbiome community profiling assays using synthetic 16S rRNA gene spike-in controls. Scientific Reports. 2018;8:9095. DOI : 10.1038/s41598-018-27314-3.
Consulter l’article dans Scientific Reports
[6] Lagerborg KA et al. Synthetic DNA spike-ins enable sample tracking and detection of inter-sample contamination in SARS-CoV-2 sequencing workflows. Nature Microbiology. 2022;7:108–119. DOI : 10.1038/s41564-021-01019-2.
Consulter l’article dans Nature Microbiology
[7] GENARO. Contrôle qualité NGS : garantir la fiabilité des données génomiques. Page pilier du Knowledge Hub GENARO.
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